После 25 дней статической инкубации при 28°C лакказа из *Pleurotus ostreatus* NRC620 показала самую высокую активность в культуральной среде гриба. Оптимальные значения pH и температуры для этого фермента составили 3,0 и 70°C соответственно. После 2 часов инкубации при 40°C и 50°C активность фермента сохранила 68,33% и 59,61% соответственно. После 2 часов инкубации в цитратно-фосфатном буфере (pH 7,0) активность фермента оставалась на уровне 100%. Добавление 10 мМ MgSO₄ и CuSO₄ увеличило активность фермента примерно на 21% и 35% соответственно, в то время как NaCl, MnCl₂, KCl и CaCl₂ ингибировали активность фермента. Используя ABTS в качестве субстрата, кинетические параметры (Km и Vmax) лакказы *Pleurotus ostreatus* NRC 620 составили 1,99 мМ и 16 217 мкмоль мин−1 л−1 соответственно. Ферментативная обработка образцов яблочного сока значительно снизила как pH, так и вязкость, и это снижение коррелировало с увеличением времени хранения. Обработка лакказой привела к незначительному снижению общего содержания фенольных соединений в яблочном соке, но снижения антиоксидантной активности не наблюдалось.
В последние годы исследователи сосредоточились на применении «зеленой» биотехнологии в пищевой промышленности. Лакказа — один из наиболее полезных ферментов в пищевой промышленности, находящий применение в таких областях, как переработка соков, выпечка, стабилизация вина и улучшение органолептических качеств пищевых продуктов.1Многие высшие растения и микроорганизмы выделяют лакказу.2Кроме того, лакказу могут продуцировать такие грибы, как дейтеромицеты, аскомицеты и базидиомицеты.3Лакказа (EC 1.10.3.2) — это синяя оксидаза, которая восстанавливает молекулярный кислород до воды, используя систему, состоящую из трех различных атомов меди, тем самым окисляя различные фенольные соединения и ароматические амины. В процессе производства фруктовых и овощных соков ферментативное и неферментативное потемнение являются критически важными проблемами.4Поскольку эти вещества негативно влияют на цвет, вкус и аромат сока, их необходимо удалить.5
Из всех фруктов яблоки являются самыми потребляемыми в мире и в Европейском Союзе. В 2019 году производство яблок заняло третье место в мире, превысив 87 миллионов тонн.6Яблоки содержат многочисленные фенольные соединения, в том числе флавоноиды и фенольные кислоты, такие как кофейная кислота и хлорогеновая кислота.7Поскольку яблочный сок обычно употребляется в прозрачном виде, в процессе фильтрации теряется примерно от 50% до 90% фенольных соединений.8Сегодня потребители, как правило, выбирают продукты минимальной обработки, такие как мутный яблочный сок с высоким содержанием полифенолов. Однако из-за высокого содержания фенолов этот вид яблочного сока особенно подвержен изменению цвета и потемнению.9Для уменьшения или предотвращения потемнения яблочного сока используются различные технологии, включая методы термической обработки, такие как пастеризация при температуре 60–90 °C.10Однако, согласно исследованию Сауседы-Гальвеса11Термическая обработка может разрушить летучие химические вещества и повлиять на органолептические качества яблочного сока. Альтернативами термической обработке являются сверхкритический диоксид углерода, ультрафиолетовое излучение, ультразвук, высокое гидростатическое давление или гомогенизация под высоким давлением.12Эффективность этих технологий и выход качественных фруктовых соков зависят от используемых параметров и характеристик продукта. Их широкое применение ограничено высокими затратами, негативным влиянием на качество некоторых пищевых продуктов или недостаточной инактивацией ферментов.13,14
Лакказу можно использовать для стабилизации и осветления фруктовых соков.15Гёкмен и др.16Рекомендуется использовать лакказу для осветления фруктовых соков, поскольку она эффективно удаляет фенольные соединения, превращая их в полимеры или олигомеры, которые легко удаляются любой ультрафильтрационной мембраной, что позволяет яблочному соку сохранять стабильный цвет и прозрачность до шести недель при температуре 50°C. Очищенная лакказа *Trichoderma* была иммобилизована на шариках из оксида алюминия и использована для селективного удаления соединений, придающих яблочному соку нежелательный привкус, вызванный микробным загрязнением.17
Примерно 80-90% летучих компонентов яблочного сока составляют сложные эфиры и альдегиды, которые придают соку неповторимый аромат.18Лакказа из *Trametes versicolor* была иммобилизована на недорогой подложке, изготовленной из натурального волокна молодых кокосовых скорлуп, для осветления яблочного сока.19В предыдущих исследованиях изучалась стабилизация яблочного сока (цвета и мутности) с использованием методов, не содержащих ферментов, или методов иммобилизации, а также в сочетании с ультрафильтрацией.5,19Однако влияние грибковых лакказ на физико-химические свойства яблочного сока во время хранения остается неясным. Поэтому целью данного исследования было экспериментальное изучение изменений физико-химических свойств, содержания фенольных соединений и антиоксидантной активности яблочного сока после обработки грибковыми лакказами и двухнедельного хранения в холодильнике. Лакказы обладают способностью окислять фенольные соединения, что делает их перспективными для использования в различных промышленных процессах, включая осветление сока. В данном исследовании изучались лакказы из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, с акцентом на идеальные условия для их активности и эффективности в осветлении сока. Хотя исследования вешенки (P. ostreatus NRC 620) все еще ограничены, в предыдущих исследованиях изучались ферменты из различных грибковых источников, таких как Trametes versicolor и Ganoderma lucidum. Целью данного исследования было оценить потенциальное применение этого фермента в пищевой промышленности и подчеркнуть его уникальные свойства, в частности, идеальный pH и температуру.
2,2′-Азооксибис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS) был приобретен у компании Sigma-Aldrich (Канада). Все остальные реактивы имели аналитическую чистоту.
Известный штамм вешенки NRC620 был получен из коллекции микробных культур Национального исследовательского центра. После пересева этот штамм хранился на скошенных чашках с картофельно-декстрозным агаром при 4°C. Метод приготовления инокулята был следующим: 10-дневный, полностью развитый мицелий инокулировали на чашки с картофельно-декстрозным агаром и инкубировали при 28°C. Через 10 дней три блока мицелия диаметром 12 мм удаляли из агаровой среды с помощью стерильного металлического пробойника и помещали в колбы Эрленмейера объемом 250 мл с ватными пробками, содержащие 50 мл стерилизованной культуральной среды (pH 5,0, как описано ранее Отманом и др.).20Культуры инкубировали при 28°C в течение 18 дней. Затем культуры фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman № 1, а полученный супернатант служил источником фермента.
Активность лакказы определяли с использованием ABTS в качестве субстрата. Реакционная смесь (2 мл) содержала 500 мкл 0,3 мМ ABTS (растворенного в 0,1 М цитратном буфере натрия, pH 4,5) и необходимое количество образца фермента, разбавленного дистиллированной водой.21,22Учитывая, что лакказа может окислять ABTS при комнатной температуре (28 °C ± 2), окисление ABTS определяли путем измерения увеличения поглощения при 420 нм (ε).420= 36 000 см-1 M -1) с использованием УФ-спектрофотометра Agilent Carry-100. Для окисления 1 мкмоль ABTS в минуту требовалась одна единица активности лакказы. Концентрацию белка определяли методом Брэдфорда, используя бычий сывороточный альбумин в качестве внутреннего контроля.23,24
После получения фермента из штамма вешенки NRC 620 его активность измеряли через различные интервалы культивирования в течение 25 дней в статических условиях при температуре 28 °C.
Для изучения влияния температуры на активность лакказы эксперименты проводились в диапазоне температур от 20 до 90 °C. Перед добавлением фермента и началом реакции буфер (0,1 М цитрат натрия, pH 4,5) и субстрат (ABTS) смешивали и инкубировали в течение 5 минут при различных температурах. Термическую стабильность фермента оценивали путем инкубации в 0,05 М фосфатном буфере натрия (pH 7,0) при 40, 50, 60 и 70 °C в течение 2 часов соответственно. Затем остаточную активность оценивали с использованием субстрата ABTS.
Влияние pH на активность лакказы оценивали, используя ABTS в качестве субстрата в 0,1 М цитратно-фосфатных буферах с диапазоном pH от 2,5 до 7,0. Раствор фермента инкубировали при 40°C в течение двух часов в 0,1 М цитратном и трис-буферах (pH 3, 4, 6 и 7) для оценки стабильности pH. Остаточную активность с ABTS в качестве субстрата рассчитывали после инкубации.
Лакказу инкубировали в течение 10 мин в фосфатном буфере натрия (0,05 М, pH 7,0), содержащем различные ионы металлов (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ и Mn2+) в концентрациях 2,5 мМ и 10 мМ соответственно. Затем добавляли субстрат (ABTS) для инициирования реакции, и оценивали относительную активность.
Окисление ABTS лакказой при различных концентрациях (0,025–3 мМ) измеряли при pH 4,5 для определения кинетических параметров (Vmax и Km). Кинетические параметрыконстантыЗначения констант уравнения Михаэлиса-Ментен были рассчитаны с использованием графика Лайнуивера-Берка, который отображает обратную величину скорости реакции в зависимости от концентрации субстрата. Кинетические константы были рассчитаны из графика Лайнуивера-Берка с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версии 6.01.
После тщательного мытья яблок водопроводной водой их разрезали пополам и выжимали сок с помощью полностью автоматической яблочной соковыжималки Braun MP80 (производство Германия). Сок фильтровали через четыре слоя марли. В контрольную группу ферменты не добавляли, в то время как в свежеприготовленный яблочный сок добавляли 2,0% лакказы (наиболее эффективная из протестированных концентраций), после чего сок хранили при температуре 4°C в течение двух недель.
Титруемая кислотность (ТА) и pH определялись по методу Болтона и др.ал.27Значение pH каждого образца измеряли с помощью цифрового pH-метра (JENWAY 3510 pH-метр). Титруемую кислотность (ТА) рассчитывали на основе яблочной кислоты по следующей формуле.
Где V и C — объем (мл) и концентрация (0,1 моль/л) раствора гидроксида натрия, использованного при титровании, соответственно. K — коэффициент конверсии яблочной кислоты, равный 0,067, а W — масса (г) яблочного сока.
Общее содержание растворимых сухих веществ (ТДССодержание целлюлозы во всех образцах сока определяли с помощью карманного рефрактометра PAL-1 (ATAGO, Токио, Япония). После каждого измерения оптическую линзу промывали деионизированной водой, и каждый образец яблочного сока тестировали трижды. Значение для каждого образца рассчитывали путем усреднения трех измерений. Среднее значение ± стандартное отклонение для каждого образца яблочного сока также рассчитывали путем усреднения этих результатов.
Вязкоупругость образцов яблочного сока оценивали с помощью ротационного вискозиметра (RV, Rheotest 2, Германия). Образец помещали внутрь цилиндра «S2» вискозиметра. Кажущаяся вязкость представлялась наклоном кривой зависимости касательного напряжения от скорости сдвига, который рассчитывали по касательному напряжению и соответствующим кривым при различных скоростях сдвига (от 1,00 до 437,4 с⁻¹). Формула для расчета кажущейся вязкости выглядит следующим образом:
Где η — кажущаяся вязкость (сП), τ — касательное напряжение (дин/см²), γ — скорость сдвига (сек⁻¹), а (τ) рассчитывается с использованием значений крутящего момента (α) и цилиндра (Z) по следующей формуле: τ = Z . α.
Индекс потемнения определяли по методу Мейдава и др.ал.29Образец сока объемом 10 мл центрифугировали при 2750 xg в течение 10 мин. 5 мл надосадочной жидкости сока смешивали с 5 мл 95% этанола. Абсорбцию смеси измеряли при 420 нм с помощью УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC).
Общее содержание фенольных соединений (ОСФС) определяли колориметрическим методом с использованием реактива Фолина-Циокалтеу, как описано Боултоном и др.[27Была построена стандартная калибровочная кривая галловой кислоты для концентраций от 0 до 500 мг/л.р²= 0,997). Результаты выражены в эквивалентах галловой кислоты (мг ГАЭ/мл).
Добавьте 125 мкл дистиллированной воды и 2850 мкл раствора FRAP к 25 мкл яблочного сока и оставьте смесь в темноте на некоторое время.30мин. Затем измерьте поглощение при 593 нм с помощью УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC). Реагент FRAP был приготовлен путем смешивания 300 мМ ацетатного буфера (pH 3,6), 20 мМ хлорида железа(III) и 10 мМ 2,4,6-трис(2-пиридил)триазина (TPTZ) (растворенного в 40 мМ HCl) в соотношении 10:1:1. Стандартная кривая была построена с использованием тролокса в качестве стандарта.Р²= 0,999), а результаты выражены в мкМ Тролокса/мл.
Антиоксидантная активность обработанных и необработанных соков определялась с использованием метода DPPH для оценки их способности нейтрализовать свободные радикалы DPPH.31Десять микролитров сока смешивали с 1 мл раствора DPPH (100 мкМ) в метаноле. После реакции в темноте в течение 30 мин абсорбцию смеси измеряли при 517 нм с помощью УФ-спектрофотометра Shimadzu (UV-1601 PC). Результаты выражали в тролокс-эквивалентах (мкМ тролокса/мл) на основе калибровочной кривой.R2= 0,990).
Полученные данные показали, что максимальная выработка лакказы наблюдалась у вешенок сорта NRC 620 к концу 18-го дня ферментации, достигнув активности 1302 Ед/л. Это послужило основой для определения оптимального времени культивирования для производства лакказы (рис. 1). Хотя выработка фермента увеличивалась с увеличением времени культивирования, темп увеличения не был прямо пропорционален времени культивирования; после 21 дня активность фермента увеличилась всего на 90 Ед/л (до 1390 Ед/л). Поэтому в конечном итоге 18 дней были выбраны в качестве оптимального времени культивирования, чтобы сбалансировать выход продукта с экономическими выгодами от увеличения времени культивирования.
Влияние времени культивирования на выход лакказы у Pleurotus ostreatus NRC 620. Три (12 мм) блока мицелия гриба были инокулированы в 50 мл стерильной среды, а затем культивировались при 28 °C в течение различного времени.
В соответствии с результатами других исследований, наши данные указывают на то, что идеальный период культивирования для достижения пиковой секреции лакказы грибами, вероятно, составляет от 7 до 36 дней.32Согласно Эзике и др.33Штамм *Trametes polyzona* WRF03 к концу девятого дня ферментации продуцировал наибольшее количество лакказы со специфической активностью 1637 Ед/мг белка. Кроме того, Отман и др.34Было установлено, что *Trichoderma harzianum* S7113 выделяет большое количество лакказы на пятый день культивирования. Скорость производства лакказы достигла пика активности на четырнадцатый день, а затем постепенно снижалась.34Хотя секреция ферментов может происходить и во время основной фазы роста, обычно она достигает пика в промежуточной фазе и запускается потреблением источника углерода или азота.34,35
Хотя лакказа из Pleurotus ostreatus NRC 620 проявляла высокую активность в широком диапазоне температур от 50°C до 80°C, приближаясь к пиковой активности (69–98%), ее максимальная активность наблюдалась при 70°C (рис. 2а). За пределами этого температурного диапазона активность фермента снижалась примерно при 70°C. Эти результаты позволяют предположить, что фермент активен при высоких температурах, вероятно, потому что высокая температура увеличивает кинетическую энергию реакции.
Влияние температуры реакции (а) и pH (б) на активность лакказы в *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Температуры в диапазоне от 20 до 90 °C достигались путем предварительной инкубации смеси при различных температурах в течение 5 минут перед добавлением фермента и началом реакции. Влияние pH на активность лакказы оценивали с использованием ABTS в качестве субстрата в растворах, содержащих 0,1 М цитратно-фосфатный буфер в диапазоне pH от 2,5 до 7,0.
Согласно Эзике и др.ал.33Оптимальная температура для лакказы *Trametes polyzona* WRF03 составляет 55 °C, что совпадает с температурой для *Ganoderma lucidum*.лакказе36и аналогично оптимальной температуре (50 °C) для *Trametes polyzona* KU-RNW02737лакказа . Балдриан38Следует отметить, что, как и для других ферментных систем, разлагающих лигнин, идеальный температурный диапазон для лакказы составляет от 50 до 70 °C.
Результаты показали, что фермент проявлял наибольшую активность при pH 3,0, достигая 94% активности при pH 3,5. Однако он оставался активным в широком диапазоне pH от 2,5 до 7,0 (рисунок 2b). Кроме того, он проявлял более высокую активность в кислых условиях по сравнению с нейтральными или щелочными условиями. Его активность оставалась не менее 77% в диапазоне pH от 2,5 до 4,5, но достигала лишь приблизительно 38% при pH 7,0. Оптимальный pH для лакказы из *Trametes polyzona* WRF03 составлял 4,533, что совпадает с pH для лакказ из *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 и *Trametes hirsuta* 41. Однако, согласно исследованию Chairin et al.42Оптимальный pH для лакказы из *Polymorpha f. sp.* WR710-1 составляет 2,2, тогда как оптимальный pH для лакказы из *Polymorpha f. sp.* IBL-04 составляет 5,043. Связывание гидроксид-анионов (ингибитора лакказы) с атомами меди лакказы T2/T3 может быть причиной снижения активности лакказы в нейтральных или щелочных условиях pH. Это может нарушить внутренний перенос электронов от центра T1 к центру T2/T3, тем самымограничивающийактивность фермента23,44
В результате инкубации фермента при различных температурах было установлено, что как время, так и температура инкубации влияют на стабильность фермента. Примечательно, что лакказа из *Trametes polyzona* NRC 620 продемонстрировала более высокую стабильность при 40℃ и 50℃, сохранив 68,33% и 59,61% своей первоначальной активности соответственно после 120 минут (рисунок 3a). В отличие от этого, в тех же условиях (40℃ и 50℃, 120 минут) лакказа из *Trametes polyzona* WRF03 сохранила 64,38% и 42,92% своей активности соответственно.33Напротив, увеличение времени инкубации и температуры снижало стабильность лакказы *Trametes polyzona* NRC 620; после инкубации при 60℃ и 70℃ в течение 60 минут ее активность снизилась до 39,24% и 1,72% соответственно (рисунок 3а). В соответствии с экспериментальными результатами, лакказа из *Trametes polyzona* WRF03 показала более высокую стабильность при 40 и 50℃ на протяжении всего процесса термической обработки.33Аналогично, Lueangjaroenkit etал.37и Chairin etал.42Была отмечена стабильность лакказ из Trametes polyzona KURNW027 и Trametes polyzona WR710-1 при температуре 50 °C в течение 1 часа. Как полезный биокатализатор, применимый в различных биотехнологических областях, лакказа должна обладать хорошей стабильностью и эффективностью в широком диапазоне температур.
Термостатическая стабильность (а) и стабильность по pH (б) лакказы из *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Термостатическую стабильность оценивали путем инкубации раствора фермента в 0,05 М фосфатном буфере натрия (pH 7,0) при 40, 50, 60 и 70 °C в течение 2 часов соответственно. Стабильность по pH оценивали путем инкубации раствора фермента в 0,1 М цитратном буфере и трис-буфере (pH 3, 4, 6 и 7) при 40 °C в течение 2 часов. Остаточную активность рассчитывали с использованием ABTS в качестве субстрата после инкубации.
Для определения оптимальных условий использования и хранения фермента мы исследовали влияние pH на стабильность лакказы. Воздействие различных значений pH существенно влияло на стабильность белковой структуры, тем самым влияя на стабильность и активность молекулы фермента. Результаты показали, что фермент был менее стабилен в кислых условиях, в то время как он демонстрировал лучшую стабильность при более высоких значениях pH (нейтральная и щелочная области). При значениях pH 7,0, 6,0, 4,0 и 3,0 показатели сохранения фермента через 120 минут составляли приблизительно 100%, 62,54%, 52,39% и 11,14% соответственно (рис. 3b). Лакказа *Strombus multisus* WRF03 показала более высокую стабильность при нейтральных значениях pH (5,5–6,5) и более низкую стабильность при кислых значениях pH (ниже 4,0). После 120 минут при значениях pH 5,5, 6,0 и 6,5 показатели удержания фермента составили приблизительно 82%, 100% и 93% соответственно.33Хайрин и др.42отметили, что лакказа из Trametes polyzona WR710-1 была стабильна в диапазоне pH от 6,0 до 7,0, в то время как Саид и др.45Исследования показали, что лакказа более стабильна в условиях нейтрального pH. Однако лакказа из Cerrena unicolor также проявляла стабильность в щелочных условиях (pH 9,0).46Исследованные лакказы продемонстрировали высокую стабильность в широком диапазоне pH. Это может быть важной характеристикой для промышленного применения.
Поскольку некоторые ионы металлов оказывают как стимулирующее, так и ингибирующее воздействие на активность ферментов, их влияние на активность ферментов необходимо учитывать в промышленных приложениях. Это крайне важно, поскольку ионы металлов являются распространенными загрязнителями окружающей среды, которые могут влиять на стабильность и синтез внеклеточных ферментов.47Для исследования влияния различных ионов металлов на лакказу из *Pleurotus ostreatus* NRC 620 мы провели соответствующие эксперименты. Как показано на рисунке 4, в зависимости от типа используемого металла, увеличение концентрации ионов металла с 2,5 мМ до 10 мМ отрицательно влияло на функцию фермента. Например,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, иCu²⁺может стимулировать и активировать активность фермента, в то время какNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, иК⁺могут ингибировать активность фермента. При концентрации 10 мМ ионы Cu²⁺ и Mg²⁺ были наиболее мощными активаторами активности лакказы из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, обеспечивая степень активации приблизительно 34% и 20% соответственно. Однако при концентрации 10 мМ ионы Ca²⁺ были наиболее мощным ингибитором лакказы, снижая активность фермента приблизительно на 60%.
Влияние ионов металлов на активность лакказы Pleurotus ostreatus NRC 620. Лакказу инкубировали в течение 10 минут в фосфатном буфере натрия (0,05 М, pH 7,0), содержащем различные ионы металлов в концентрациях 2,5 мМ и 10 мМ. Затем реакцию инициировали добавлением субстрата (ABTS), после чего измеряли относительную активность.
Наши результаты согласуются с результатами других авторов, которые обнаружили, что Mg²⁺ и Cu²⁺ усиливают активность *Trametes polyzona* WRF03³. Кастаньо и др.⁴⁸ обнаружили, что лакказа из *Xylaria* sp. в некоторой степени стимулируется ионами меди (Cu²⁺). Кроме того, Форутанфар и др.⁴⁹ и Си и др.⁵⁰ провели аналогичные исследования лакказ из *Paraconiothyrium variabile* и *Trametes pubescens* соответственно. Медьсвязывающий участок типа II (T2) этого фермента может быть насыщен Cu²⁺ при заданной концентрации, что может объяснить стимуляцию активности лакказы при более высоких концентрациях Cu²⁺³⁹. Поскольку лакказы белых гнилостных грибов являются оксидазами, содержащими множество атомов меди, воздействие ионов меди на активность лакказы разнообразно и варьируется от стимулирующего и ингибирующего до нейтрального.⁵¹ В отличие от этого, Чжоу и др.. [52]сообщили, чтоCu²⁺подавляли активность лакказы тайваньского подземного термита (Odontotermes formosanus). Однако лакказы Cerena sp. HYB07[53]и Clitocybe maxima[54]ионы меди на них не воздействовали.
Специфичность субстрата была представлена его кинетическими параметрами (Km и Vmax); чем сильнее сродство связывания субстрата с ферментом, тем ниже значение Km и тем выше специфичность субстрата.3,21,55Кинетические параметры (Km и Vmax) лакказы из *Pleurotus ostreatus* NRC 620 были определены с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0 путем построения графика Лайнуивера-Берка (рисунок 5). При использовании ABTS в качестве субстрата результаты составили 1,99 мМ и 16217 мкмоль.мин⁻¹ Л⁻¹,соответственно. Эльсаед и др.21Было установлено, что значения Km для окисления ABTS составляют 0,1 мМ и 0,064 мМ соответственно, что указывает на высокое сродство изоферментов Lac A и Lac B к ABTS. Кроме того, значения Vmax составили 0,182 мкмоль.мин⁻¹и 0,603 мкмольмин⁻¹соответственно. Полученное значение Km было ниже, чем у Trametes polyzona WRF03 (8,66 мМ); кроме того, их значение Vmax (1429 ммоль мин⁻¹) также было ниже.нижепри использовании ABTS в качестве субстрата.33 Аналогично, значения Km для концентраций лакказы Lentinus squarrosulus MR13 и Trametes sp. AH28-2 составляли 0,0714 мМ и 0,025 мМ соответственно, а значения Vmax — 0,0091 мМ мин−1 и 0,67 мМ мин−1 мг−1 (относительно ABTS).соответственно.56,57
Было исследовано влияние концентрации ABTS на активность лакказы из *Pleurotus ostreatus* NRC 620, и построен график Лайнуивера-Берка зависимости обратной величины начальной скорости реакции от концентрации ABTS. Реакция окисления ABTS с различными концентрациями (0,025–3,0 мМ) лакказы измерялась при pH 4,5 для определения кинетических параметров (Vmax и Km). Кинетические константы Михаэлиса-Ментен рассчитывались с использованием графика Лайнуивера-Берка зависимости обратной величины скорости реакции от концентрации субстрата. Кинетические константы рассчитывались из графика Лайнуивера-Берка с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.01.
Традиционные осветляющие ферменты, такие как пектиназы, гидролизуют пектиновые вещества, снижая вязкость и мутность. Они эффективно расщепляют структурные полисахариды и часто используются в сочетании с другими ферментами, такими как целлюлазы и гемицеллюлазы, для повышения выхода и прозрачности. Однако пектиназы не нацелены конкретно на фенольные соединения, которые являются основными причинами мутности и окислительного потемнения, особенно в таких соках, как яблочный и виноградный.58В отличие от этого, лакказы катализируют окисление фенольных соединений, полимеризуя их в более крупные, нерастворимые молекулы, которые могут быть удалены путем седиментации или фильтрации. Этот механизм не только улучшает прозрачность, но и продлевает срок хранения сока, снижая вероятность окислительного потемнения, вызванного фенольными соединениями. Кроме того, процессы осветления на основе лакказ могут проводиться в мягких условиях (pH 3,5–5,5, температура 25–40 °C), что делает их подходящими для деликатных соков без ущерба для их питательных или органолептических свойств.59Исследования показали, что обработка пектиназой позволяет осветлить сок за 1–2 часа, в то время как обработка лакказой обычно требует более длительного времени реакции (3–6 часов) для полного восстановления фенольных соединений. Однако этот процесс можно оптимизировать путем иммобилизации фермента или путем сочетания лакказы с методами механического осветления.60В данном исследовании ферментативный профиль неочищенного экстракта выявил значительную активность лакказы и α-амилазы, в то время как активность пектиназы и ксиланазы была крайне низкой, а активность целлюлазы не была обнаружена. Следовательно, снижение мутности и содержания фенольных соединений было в основном обусловлено действием лакказы, тогда как изменение вязкости могло быть частично обусловлено действием амилазы.
В таблице 1 представлены физико-химические параметры свежевыжатого яблочного сока и образцов, обработанных лакказой. Результаты показали, что выход свежевыжатого яблочного сока (71,59%) был ниже, чем у образцов, обработанных лакказой (87,34%). Эти результаты согласуются с выводами Пильника и Оранжа.61Было отмечено, что использование ферментов в переработке фруктов может увеличить выход сока, улучшить фильтрацию и получить высококачественный, прозрачный сок для концентрирования. Увеличение выхода сока в основном обусловлено увеличением содержания растворимых сахаров в соке. В процессе ферментативного гидролиза фруктов мезоглея и пектин в клеточных стенках продукта разрушаются и превращаются в растворимые вещества, такие как нейтральные сахара и кислоты.62.Значение pH яблочного сока, обработанного ферментами, было значительно ниже, чем у контрольной группы (P < 0,05), и значение pH обеих групп значительно увеличилось в процессе хранения (таблица 1). Эти результаты согласуются с результатами исследования Марка и др.63Было отмечено, что pH сока плодов кешью снижался после хранения после термической обработки. Причиной повышения pH во время хранения может быть деградация пектина и образование галактуроновой кислоты после обработки ферментами. pH образцов, обработанных ферментами, оставался в пределах от 4,05 до 4,31 на протяжении всего хранения, в то время как pH необработанного яблочного сока колебался в пределах от 4,12 до 4,33.
Общая кислотность (АК) как необработанных, так и обработанных лакказой образцов показала тенденцию к снижению с увеличением времени хранения (таблица 1). Снижение кислотности объясняется превращением органических кислот в углеводы или ферментативными реакциями, а также окислением во время хранения сока.64Общая кислотность контрольного яблочного сока и образцов, обработанных ферментами, была ниже, чем у других соков (клубничный сок 0,9%, сливовый сок 2,2%, сок кумквата 1,0%, абрикосовый сок 2,4%, апельсиновый сок 0,8%), но аналогична кислотности других соков (например, грушевый сок 0,3%).62Эти различия в свежевыжатом яблочном соке, не подвергавшемся обработке, могут быть обусловлены различными факторами, такими как условия выращивания, генетические особенности, степень зрелости и методы обработки.65Снижение общей кислотности контрольного и обработанного лакказой яблочного сока согласуется с результатами, представленными Сингхом и др.66Что касается снижения общей кислотности яблочного сока сорта Цзинь Нуо после 74 дней хранения, то Ошмянский и Войдыло...67При изучении влияния традиционных методов осветления существенных изменений кислотности яблочного сока обнаружено не было.
Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что содержание общего количества растворимых сухих веществ (TSS) в яблочном соке, обработанном лакказой, было выше, чем в необработанном образце. Эти результаты согласуются с опубликованными исследованиями.. 68Кроме того, в таблице 1 показано, что значение общего содержания растворимых сухих веществ (TSS) в контрольной группе яблочного сока составляло 9,58 в начальный момент времени и достигло 11,05 к концу периода хранения. Эти значения ниже, чем значения TSS свежего яблочного сока, приведенные Хамидом и др.. 69(11,2 и 11,80 соответственно). Значение общего содержания растворимых сухих веществ (TSS) в образцах яблочного сока, обработанных лакказой, значительно увеличилось, начиная с 11,23 и достигнув 12,93 после двух недель хранения при 4 °C (таблица 1). Аналогичное увеличение TSS во время хранения наблюдалось также в цитрусовых, лимонах и сладких апельсинах. Увеличение общего содержания растворимых сухих веществ (TSS) во время хранения может быть связано с гидролизом полисахаридов (крахмала) до моносахаридов (сахаров), увеличением концентрации из-за обезвоживания сока и деградацией пектина в соке до растворимых сухих веществ. Увеличение общего содержания растворимых сухих веществ (TSS), вероятно, связано с увеличением количества растворимых сахаров, которые могут образовываться в результате превращения пектина или целлюлозы в растворимые сахара под действием пектина или целлюлазы соответственно, или в результате гидролиза крахмала до сахаров, как сообщали Хамед и др.69.Влияние лакказы на свойства яблочного сока можно наблюдать визуально: обработанный лакказой яблочный сок демонстрирует лучшую текучесть и меньшую вязкость, чем необработанный сок. Это наблюдение зафиксировано в таблице 1; вязкость образца, обработанного ферментом, составила 1,87 сП, тогда как вязкость контрольного образца — 2,95 сП. Такое значительное снижение вязкости, вероятно, обусловлено более высокой водоудерживающей способностью пектиноподобных веществ и образованием когезивной сетевой структуры.
В данном исследовании изучалось влияние лакказы на индекс потемнения (ИП) яблочного сока путем измерения поглощения при 420 нм с использованием спектрофотометра. Результаты представлены в таблице 1. В процессе хранения ИП образцов яблочного сока как в обработанной, так и в необработанной группах демонстрировал тенденцию к постепенному увеличению. ИП отражает степень потемнения и может служить в качестве индикатора степени потемнения.важныйиндикатор ферментативных и неферментативных реакций потемнения. Абсорбция значительно увеличилась в процессе хранения (P < 0,05). В конце хранения...А420Значения содержания питательных веществ в образцах яблочного сока в контрольной и обработанной ферментами группах увеличились примерно на 217% и 121% соответственно (таблица 1). Результаты показывают, что обработка ферментами может эффективно снизить степень потемнения примерно на 56%. Результаты Безерры и др.[19] согласуются с нашими результатами; они использовали лакказу-глутаральдегид-кокосовое волокно для осветления яблочного сока, уменьшив его первоначальный цвет на 61%.
Несмотря на то, что полифенолы во фруктовых соках оказывают положительное питательное и терапевтическое воздействие на организм человека, они также могут вступать в реакцию с белками, вызывая помутнение сока, образование осадка или мутность, тем самым изменяя вкус и аромат продукта и сокращая срок его хранения.71Целью данного исследования было безопасное снижение содержания фенольных соединений в яблочном соке с использованием лакказы из Pleurotus ostreatus NRC 620. Результаты, представленные в таблице 1, показывают, что общее содержание фенольных соединений в яблочном соке, обработанном лакказой, значительно снизилось до хранения при 4 °C. Кроме того, общее содержание фенольных соединений также уменьшилось в процессе хранения в обоих исследованных образцах (таблица 1). Исследование Сандри и др.72Исследования показали, что яблочный сок, обработанный ферментами, может сохранять свою антиоксидантную активность и содержание фенольных соединений. Однако результаты исследования Леттеры и др.73Исследования показывают, что обработка апельсинового сока грибковой лакказой может снизить содержание в нем фенольных соединений до 45%.
Было показано, что фенольные соединения обладают такими свойствами, как нейтрализация свободных радикалов, восстановление и гашение синглетного кислорода, перенос атомов водорода и передача электронов свободным радикалам, что делает их мощными антиоксидантами.74Таким образом, в данном исследовании для оценки влияния лакказы на антиоксидантную активность яблочного сока, хранившегося в холодильнике в течение 14 дней, были использованы методы, основанные на DPPH и FRAP (таблица 2). Оба метода показали увеличение антиоксидантной активности в процессе хранения, что может быть связано с увеличением количества свободных фенольных соединений или образованием продуктов реакции Майяра (ПРМ), причем продукты реакции Майяра, вероятно, являются причиной увеличения антиоксидантной активности.75В результате неферментативных реакций потемнения (включая разложение аскорбиновой кислоты, реакции Майяра и кислотно-катализируемое разложение сахаров) образуются коричневые пигменты (меланоидины). Промежуточные продукты разложения аскорбиновой кислоты и продукты разложения сахаров (такие как карбонильные соединения) могут реагировать с аминокислотами посредством реакций Майяра.76Несмотря на то, что процесс потемнения фруктов и овощей во время хранения был extensively изучен, наше понимание этих реакций остается ограниченным.77По сравнению с методом FRAP, обработанный лакказой яблочный сок показал значительно более низкую антиоксидантную активность по методу DPPH (таблица 2), при этом антиоксидантная активность всех образцов значительно возрастала с увеличением времени хранения. В данном исследовании использовались два разных метода определения антиоксидантной активности, поскольку их принципы различаются. Метод DPPH измеряет способность нейтрализовать свободные радикалы, тогда как метод FRAP измеряет способность восстанавливать ионы железа. Поэтому рекомендуется использовать несколько методов определения антиоксидантной активности для лучшего понимания антиоксидантной активности исследуемых образцов.78
Одним из ключевых результатов этого исследования является то, что лакказа *Pleurotus ostreatus* NRC 620 проявляет оптимальную активность при 70°C и pH 3,0. По сравнению с другими грибными лакказами, обычно используемыми для осветления соков, такими как лакказы *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum*, *P. ostreatus* NRC 620 демонстрирует более высокую термостабильность и более кислый pH. Лакказы из *Trametes versicolor* и *Ganoderma lucidum* обычно проявляют оптимальную активность в диапазоне 50-60°C и при значениях pH от 3,5 до 5,0. Это различие может способствовать повышению эффективности осветления соков, особенно кислых соков, где стабильность при более низких значениях pH имеет решающее значение. Уникальная характеристика *P. По сравнению с другими изученными грибными лакказами, *Pleurotus ostreatus* NRC 620 демонстрирует способность эффективно функционировать в более сложных условиях. Более высокая оптимальная температура активности предполагает потенциальные преимущества в промышленном применении, такие как более высокая скорость реакции и снижение микробного загрязнения. Низкий pH, хорошо подходящий для кислой природы многих соков, может быть полезен в процессах осветления соков. Эти результаты оправдывают дальнейшие исследования для крупномасштабного применения, делая *Pleurotus ostreatus* NRC 620 жизнеспособной альтернативой традиционным источникам грибных лакказ. По сравнению с предыдущими исследованиями мы обнаружили, что оптимальная температура составляет 60°C, а оптимальный pH — 3,0. После реакции при 60°C в течение 80 минут лакказа *Ganoderma lucidum* сохранила свою активность.46% его активности.79 Согласно Курниавати и Ниселле80Ферменты *Ganoderma lucidum* демонстрируют отличную до умеренной стабильности при 25°C и значениях pH от 5,0 до 8,0, а также стабильность при pH 6,0 и температурах от 10 до 30°C. В данном исследовании мы установили, что оптимальные значения pH и температуры для активности фермента *Pleurotus ostreatus* составляют 3,0 и 70°C соответственно. После инкубации при 40°C и 50°C в течение двух часов фермент сохранил 68,33% и 59,61% своей активности соответственно. Кроме того, лакказа NRC 620 Pleurotus ostreatus проявляла высокую активность в широком диапазоне температур от 50°C до 80°C, почти достигая максимальной активности (69%–98%), при этом максимальная активность наблюдалась при 70°C.
В заключение, лакказа NRC620 из вешенки, полученная в статических условиях, продемонстрировала оптимальную активность и стабильность в широком диапазоне pH и температур, показав превосходную стабильность по сравнению с другими источниками ферментов. Добавление 10 мМ MgSO₄ и CuSO₄ увеличило активность фермента примерно на 21% и 35% соответственно. При переработке в яблочный сок фермент снизил pH и вязкость, в то время как содержание фенольных соединений уменьшилось лишь незначительно во время хранения.
Результаты подтверждают потенциал лакказы в пищевой промышленности, особенно в осветлении напитков. Целенаправленно расщепляя фенольные соединения, лакказа не только снижает мутность и улучшает прозрачность, но и поддерживает качество фруктовых соков в мягких условиях эксплуатации. В отличие от традиционных осветляющих агентов, таких как желатин, бентонит и силикагель, лакказа не образует отходов и не удаляет приятные ароматы из напитков, что делает её более экологичным и устойчивым вариантом. Кроме того, по сравнению с другими ферментами и методами фильтрации, лакказа предлагает целенаправленное и экономически эффективное решение без ущерба для качества продукта.
Кёмухимбо, Х.Д. и Бринк, Х.Г. Применение и стратегии иммобилизации медьсодержащих лакказ; обзор. Heliyon 9, e13156 (2023).
Дата публикации: 15 декабря 2025 г.